dag 4

Dag 4:
Stringens tvätt och detektion

vi tvättade membranet med SSC, Rt och SSC 65°c för att ta bort semi-komplementära H-bindningar genom att sänka [Na⁺] och öka temp. sedan tillsatte vi buffert som innehöll anti-DIG-alkalinfosfatas antikroppar som reagerar med substratet och bildar en färgad produkt som detekterar endast den sekvens som inmärkta proben har bundits specifikt.

Bilden visar att vi har lyckat med hybridisering och det finns band motsvarar LL37 genen, och finns ingen backgrund .

från vänster visar klyvd plasmid 0, 5 µg, en stark hybridiserings band som motsvarar LL37 och samtidigt finns flera band till på översta delen det visar att det kan finnas ospecifika hybridiseringar med olika storleker eller kan visa vektorer fortfarande oklyvda som har kvar sin insert eller det kan bilda ospecifika klyvningar, som syns med olika storleker och vandrar med olika avstånd,

band vid 0,005 µg i mitten syns en svag band som motsvara LL37 och samtidigt finns annan band under LL37 bandet det kan ha samma förklaring att det finns ospecifika hybridiseringar.

I oklyvd plasmid bandet till höger syns olika bildningar eftersom det är en renad plasmid men det kan vara att ha olika formar som linjära eller semi cirkulär och cirkulära former det leder till att vandrar olika pga olika form.

1.       Nu har du gjort både PCR och Southern. Syftet med bägge metoderna var att ta redapå om LL 37-genen fanns i plasmiden. Jämför resultatet och diskutera för-och nackdelar med metoderna.

Båda metoderna kan användas för identifiering av vis sekvens och känsliga, fördelen med PCR metoden är att man kan jämföra klyvda produkter med markörer, ger uppskattning snabbt om det finns LL37 och genom den positiva och negativa kontrollen man försäkrar analysen från falskt positiv och falskt negativ svar.

Southern metoden är mer specifikt än PCR, eftersom proben binder specifikt och detekterar bara den målsekvensen som vi letar efter, banden mer tydliga och samtidigt den detekterar i små mängder som PCR kan inte påvisa det

Nackdelen är att den tar längre tid, består av många steg som prehybridisering, probe inmärkning och hybridisering och tvätt, alla steg krävs mindre eller 1 timme väntetid, om alla steg inte utförs under optimala förhållanden som temperatur och tid risken finns för ospecifika hybridiseringar,

1.      Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen?  

Det viktigaste som jag har lärt mig under laborationen är att kunna praktisera mer och använda teori kunskapen samtidigt, och har lärt mig laborera med mer noggrannhet och blir mer laborationsvana, den tycker jag en viktig karv som BMA ska vara noggrant och ansvarsfull laborant.

Dag 3

Efter att vi har konstaterat att PCR har fungerat och amplifikatet är LL37 men det är inte helt säkert om det verkligen är LL37 sekvens, därför fortsatte vi med andra metoden Southern blot. Med denna metod påvisar om det är LL37 eller någon annan produkt.

Metoden börajde vi med klyvning av rekombinanta plasmiden med ECOR1 restriktionsenzym, separation av vektor och insert med gelelktrofores , identifiering mha standard markör 3 och 9, fotografering.

Bilden visar två starka tydliga band i 0,5 µg konc. som representerar insert LL37 nedersta bandet, hamnar ovan på 603 bp på markör 9 och vektorn översta bandet vid 2900 bp.

men vektor bandet har lite spridit, pga att det kan vara andra partiklar som har kommit till brunnen t.ex. vid pipiteringen eller att enzymet har klyft vektorn på andra ställe som leder till att bilda andra produkter med olika storleker.

Sedan med Southern bloting överförde vi gelen till ett nylon membran och drogs ut vätskan mha flera skikt underlag av pappershandduk, watmans papper och  blöt med SSC lösning och täcktes under täcktglas i 1 timme. Efter bloting gjorde vi DNA fixering, placerades membranet i UV-cabinet i 3 minuter för att DNA korslinker och fastnar till membranet.

probe inmärkning gjorde vi med DIG-dUTP genom random-priming process, därefter gjorde vi prehybridisering för att blockera positiva laddningar på membranet för att undvika ospecifika bindningar, sedan inkuberade vi membranet med proben för hybridisering i 65°C/ Ö.N.