Dag 3

Efter att vi har konstaterat att PCR har fungerat och amplifikatet är LL37 men det är inte helt säkert om det verkligen är LL37 sekvens, därför fortsatte vi med andra metoden Southern blot. Med denna metod påvisar om det är LL37 eller någon annan produkt.

Metoden börajde vi med klyvning av rekombinanta plasmiden med ECOR1 restriktionsenzym, separation av vektor och insert med gelelktrofores , identifiering mha standard markör 3 och 9, fotografering.

Bilden visar två starka tydliga band i 0,5 µg konc. som representerar insert LL37 nedersta bandet, hamnar ovan på 603 bp på markör 9 och vektorn översta bandet vid 2900 bp.

men vektor bandet har lite spridit, pga att det kan vara andra partiklar som har kommit till brunnen t.ex. vid pipiteringen eller att enzymet har klyft vektorn på andra ställe som leder till att bilda andra produkter med olika storleker.

Sedan med Southern bloting överförde vi gelen till ett nylon membran och drogs ut vätskan mha flera skikt underlag av pappershandduk, watmans papper och  blöt med SSC lösning och täcktes under täcktglas i 1 timme. Efter bloting gjorde vi DNA fixering, placerades membranet i UV-cabinet i 3 minuter för att DNA korslinker och fastnar till membranet.

probe inmärkning gjorde vi med DIG-dUTP genom random-priming process, därefter gjorde vi prehybridisering för att blockera positiva laddningar på membranet för att undvika ospecifika bindningar, sedan inkuberade vi membranet med proben för hybridisering i 65°C/ Ö.N.