Dag2
 |
| gelelektrofores |
-
Brunnarnas ordning från vänster till höger:
Neg. Kont, oklyvd plasmid, positiv kont, markör III, PCR-produkt (prov), markör IX.
Resultatet ser bra ut, vi har testat några kontroller enligt bilden,
1. Negativ kontroll: vatten istället för templat bevisar att det finns ingen templat i provet, det blir ingen produkt som vi ser ingen distinkta band vilket betyder att vi har inte fått någon kontaminering från omgivningen och ingen falskt positivt svar
1. Negativ kontroll: vatten istället för templat bevisar att det finns ingen templat i provet, det blir ingen produkt som vi ser ingen distinkta band vilket betyder att vi har inte fått någon kontaminering från omgivningen och ingen falskt positivt svar
2. Positiv kontroll: vi tillsatt känd sekvens LL37, 550 bp för att bevisa att vi har LL37 i vårt prov genom att jämföra PCR-produkt band och positiv kontroll som har båda likadana band i samma avstånd som bevisar att PCR produkten har samma sekvens som LL37 sekvens.
3. Markörer: tillsattes markör III och markör IX
Markör 3, har ingen band jämföra med, däremot om jämförs PCR band och markör 9, PCR bandet hamnar i samma avstånd som motsvarar bandet under 603 bp på markör 9 som motsvarar band ~ 550 bp, den förstärker beviset att PCR reaktionen har fungerat, och primrarna har bundits till DNA-plasmid templatet, och amplifikat produkten har rätt storlek som avståndet mellan båda primrarna och lika stor som LL37 genen
4. oklyvd plasmid: visar två band, översta bandet bevisar att det är ett DNA plasmid, pga storleken som stor molekyl har inte vandrat så långt, och andra bandet som hamnar nere i samma avstånd som positiv kontrollen har, det beror på att antingen har oklyvda plasmiden kontaminerat med pisitiv kontrollen eller plasmiden har klyft LL37 under bearbetning.
- Om resultatet blev misslyckat; vad tror du är den troligaste orsaken till att det misslyckades?
Misslykat resultat innebär att bildas ingen produkt, pga:
brist på templat gör att bildas primer-dimer, blir ingen produkt,
brist på [Mg2+] minskar polymeras aktivitet, eftersom Mg joner fungerar som kofaktor till enzymet, midre aktivitet mindre produkt.
Brist på dNTP, mindre mängd byggstenar, mindre produkt.
Brist på primer, brist på produkt,
Val av optimering av temp och tid har stor betydelse. Fel temp och fel tid, fel hybridisering, fel produkt eller ingen produkt.
Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgången nästa labdag eller vid labuppföljningen?
Roligt att ni fick ett bra resultat.
SvaraRaderaDu har skrivit väldigt utförligt på din blogg, det räcker med att du besvarar de frågor som finns för respektive dag, alltså framförallt reflekterar över era resultat.
Er absorbans indikerar att ni har ren nukleinsyra i er preparation som du skriver. Om ni hade haft proteiner med så skulle kvoten blivit lägre. Det är alltså inte möjligt att "andra proteiner" finns med om man har en sådan kvot.
Annica
Fint!
SvaraRaderaEftersom ni lyckades få fram det önskade resultatet så borde du inte nämna om varför resultat misslyckats. Viktig att resonerar kring ert egna resultat, vilket du har gjort, där du beskrev om brunnarna.
Dieu Linh
Hej Jiyan! Ni har lyckats bra med PCR och du diskuterar bra kring kontrollernas funktion och vad som styrker erat resultat, dock krävs inte resonering kring varför försöket kan ha misslyckats som Linh säger för ni har lyckats bra! Du har smear i negativa samt positiva provet, vad kan detta bero på?
SvaraRaderaMvh Anders