dag 4

Dag 4:
Stringens tvätt och detektion

vi tvättade membranet med SSC, Rt och SSC 65°c för att ta bort semi-komplementära H-bindningar genom att sänka [Na⁺] och öka temp. sedan tillsatte vi buffert som innehöll anti-DIG-alkalinfosfatas antikroppar som reagerar med substratet och bildar en färgad produkt som detekterar endast den sekvens som inmärkta proben har bundits specifikt.

Bilden visar att vi har lyckat med hybridisering och det finns band motsvarar LL37 genen, och finns ingen backgrund .

från vänster visar klyvd plasmid 0, 5 µg, en stark hybridiserings band som motsvarar LL37 och samtidigt finns flera band till på översta delen det visar att det kan finnas ospecifika hybridiseringar med olika storleker eller kan visa vektorer fortfarande oklyvda som har kvar sin insert eller det kan bilda ospecifika klyvningar, som syns med olika storleker och vandrar med olika avstånd,

band vid 0,005 µg i mitten syns en svag band som motsvara LL37 och samtidigt finns annan band under LL37 bandet det kan ha samma förklaring att det finns ospecifika hybridiseringar.

I oklyvd plasmid bandet till höger syns olika bildningar eftersom det är en renad plasmid men det kan vara att ha olika formar som linjära eller semi cirkulär och cirkulära former det leder till att vandrar olika pga olika form.

1.       Nu har du gjort både PCR och Southern. Syftet med bägge metoderna var att ta redapå om LL 37-genen fanns i plasmiden. Jämför resultatet och diskutera för-och nackdelar med metoderna.

Båda metoderna kan användas för identifiering av vis sekvens och känsliga, fördelen med PCR metoden är att man kan jämföra klyvda produkter med markörer, ger uppskattning snabbt om det finns LL37 och genom den positiva och negativa kontrollen man försäkrar analysen från falskt positiv och falskt negativ svar.

Southern metoden är mer specifikt än PCR, eftersom proben binder specifikt och detekterar bara den målsekvensen som vi letar efter, banden mer tydliga och samtidigt den detekterar i små mängder som PCR kan inte påvisa det

Nackdelen är att den tar längre tid, består av många steg som prehybridisering, probe inmärkning och hybridisering och tvätt, alla steg krävs mindre eller 1 timme väntetid, om alla steg inte utförs under optimala förhållanden som temperatur och tid risken finns för ospecifika hybridiseringar,

1.      Vad tycker du är det viktigaste som du har lärt dig under laborationen?  

Det viktigaste som jag har lärt mig under laborationen är att kunna praktisera mer och använda teori kunskapen samtidigt, och har lärt mig laborera med mer noggrannhet och blir mer laborationsvana, den tycker jag en viktig karv som BMA ska vara noggrant och ansvarsfull laborant.

Dag 3

Efter att vi har konstaterat att PCR har fungerat och amplifikatet är LL37 men det är inte helt säkert om det verkligen är LL37 sekvens, därför fortsatte vi med andra metoden Southern blot. Med denna metod påvisar om det är LL37 eller någon annan produkt.

Metoden börajde vi med klyvning av rekombinanta plasmiden med ECOR1 restriktionsenzym, separation av vektor och insert med gelelktrofores , identifiering mha standard markör 3 och 9, fotografering.

Bilden visar två starka tydliga band i 0,5 µg konc. som representerar insert LL37 nedersta bandet, hamnar ovan på 603 bp på markör 9 och vektorn översta bandet vid 2900 bp.

men vektor bandet har lite spridit, pga att det kan vara andra partiklar som har kommit till brunnen t.ex. vid pipiteringen eller att enzymet har klyft vektorn på andra ställe som leder till att bilda andra produkter med olika storleker.

Sedan med Southern bloting överförde vi gelen till ett nylon membran och drogs ut vätskan mha flera skikt underlag av pappershandduk, watmans papper och  blöt med SSC lösning och täcktes under täcktglas i 1 timme. Efter bloting gjorde vi DNA fixering, placerades membranet i UV-cabinet i 3 minuter för att DNA korslinker och fastnar till membranet.

probe inmärkning gjorde vi med DIG-dUTP genom random-priming process, därefter gjorde vi prehybridisering för att blockera positiva laddningar på membranet för att undvika ospecifika bindningar, sedan inkuberade vi membranet med proben för hybridisering i 65°C/ Ö.N.

dag2


 Dag2

gelelektrofores

  Idag har du utfört en PCR.

-          Hur blev resultatet? Om du tycker att resultatet blev bra; vilka kontroller har du som gör att du kan lita på resultatet?

Brunnarnas ordning från vänster till höger:

Neg. Kont, oklyvd plasmid, positiv kont, markör III, PCR-produkt (prov), markör IX.

Resultatet ser bra ut, vi har testat några kontroller enligt bilden,
1. Negativ kontroll: vatten istället för templat bevisar att det finns ingen templat i provet, det blir ingen produkt som vi ser ingen distinkta band vilket betyder att vi har inte fått någon kontaminering från omgivningen och ingen falskt positivt svar

2. Positiv kontroll: vi tillsatt känd sekvens LL37, 550 bp för att bevisa att vi har LL37 i vårt prov genom att jämföra PCR-produkt band och positiv kontroll som har båda likadana band i samma avstånd som bevisar att PCR produkten har samma sekvens som LL37 sekvens.

3. Markörer: tillsattes markör III och markör IX

Markör 3, har ingen band jämföra med, däremot om jämförs PCR band och markör 9, PCR bandet hamnar i samma avstånd som motsvarar bandet under 603 bp på markör 9 som motsvarar band ~ 550 bp, den förstärker beviset att PCR reaktionen har fungerat, och primrarna har bundits till DNA-plasmid templatet, och amplifikat produkten har rätt storlek som avståndet mellan båda primrarna och lika stor som LL37 genen

4. oklyvd plasmid: visar två band, översta bandet bevisar att det är ett DNA plasmid, pga storleken som stor molekyl har inte vandrat så långt, och andra bandet som hamnar nere i samma avstånd som positiv kontrollen har, det beror på att antingen har oklyvda plasmiden kontaminerat med pisitiv kontrollen eller plasmiden har klyft LL37 under bearbetning.

-          Om resultatet blev misslyckat; vad tror du är den troligaste orsaken till att det misslyckades?

Misslykat resultat innebär att bildas ingen produkt, pga:

 brist på templat gör att bildas primer-dimer, blir ingen produkt,

brist på [Mg²⁺] minskar polymeras aktivitet, eftersom Mg joner fungerar som kofaktor till enzymet, midre aktivitet mindre produkt.

 Brist på dNTP, mindre mängd byggstenar, mindre produkt.

Brist på primer, brist på produkt,

Val av optimering av temp och tid har stor betydelse. Fel temp och fel tid, fel hybridisering, fel produkt eller ingen produkt.

Är det något du funderar på som du vill att vi tar upp vid genomgången nästa labdag eller vid labuppföljningen?

Rening av plasmid och verifiering av insert

Rening av plasmid och verifiering av insert

Syftet med laborationen är att rena fram en rekombinant plasmid från en E.coli bakteriesuspension, E.coli bakterie är en bluescript plasmid, innehåller gen LL37 som kodar för en antibakteriell peptid och därefter verifieras att plasmiden verkligen innehåller LL37 som insert. Verifiering sker på två olika sätt:

1)      Genom PCR metod med primer som binder specifikt till LL37 sekvens och med gel elektrofores identifieras bandet LL37

2)      Genom att klyva ut insert (LL37) med ECOR1 restriktionsenzym och sedan med Southern blot hybridiseras med en DIG-inmärkt probe som är specifikt för LL37 och i slutet detekteras mha.  DIG antikroppar

Dag 1:

Rening av rekombinant plasmid enl. QIAgen

Koncentrations och renhetsbestämning av plasmidprep.

Laborationen startades med att rena DNA plasmid från suspension genom olika steg

Centrifugering: Togs 4,5 ml bakterie suspension en ependorfrör cetrifug/ 3min, hälldes supernatanten och sparades pelleten.

1.       Resuspension: pelleten löstes med olika bufferter

250 µl BP1innehåller Trisbuffert+ RNas→vortex→centrifug→hälls supernatant

2.       Lysis (denatureing): tillsätts alkalisk buffert innehåller NaOH/SDS/EDTA

250 µl BP2 innehåller NaOH+ SDS, lyseras cell membranet→ej vortex (bara blandas)→centrifug →hälls supernatant

3.       Nutralization: tillätts KAc lösning→återbildas vetebindningar

350 µl N3 innehåller acetat buffert pH 4+ högsalt konc. nutralization→blanda direkt 4-6 ggr→suspensionen blir dimmig→ centrifug 13000 rpm/10 min→hälls supernatant

4.       Clearing of lysates:

Rening på glasfiber kolonn: Hälls supernatant till QIAprep spin kolumn, alla plasmid DNA och RNA kommer att binda till kolonnen → centrifug/60 sek→hälls supernatant innehåller genomic DNA + proteiner och cell debris

Tvätt kolonn: med 0,5 ml PB buffert → centrifug/60 sek→hälls supernatant

Tvätt kolonn: med 0,75 ml PE buffert→ centrifug/60 sek→hälls supernatant

Ytterligarecentrifug/1min →tas bort resten av buffert

Placeras QIA prep kolonn i en mikrocentrifug rör

Eluering: tillsätts 50 µl EB buffert (innehåller 10mM Tris-Cl, PH 8,5)→står i 1min→centrifug/ 1min→ plasmid DNA lossnar från kolonnett och rent plasmidDNA elueras ut

Kontroll för renhet genom koncentrationsbestämning: konc av DNA (utbytet) visar hurmycket rekombinant plasmid vi har fått och den utfördes genom att:

 späda plasmidlösningen 1:100 med TE buffert PH 8,0

mätning: med ultraviolet absorbance spectrophotomery

absorbansen är proportionellt mot koncentrationen, absorbansen valdes inom intervallet mellan 230-300 nm våglängd. absorbansen på lösningen mättes vid 260 resp. 280 nm

resultat:            A260 = 0,069 Å,                  A280 = 0,034 Å

1 absorbans enhet vid 260 nm motsvarar 50 µg DNA/ ml

1 Abs/50 µg = 0,069/ x → x = 0,069 × 50µl = 3,45 µg/ml→ = 3,45/1000 µl = 0,00345 µg/µl

Provet har spat 100 ggr→ = 0,00345 µg/µl ×100 ggr = 0,345 µg/µl i provet.

Kvoten A260/ A280 har räknats ut och det blir: 0,069/ 0,034 = 2,02Kvoten visar om det finns protein föroreningar

alla nukleinsyror i lösningen bidrar till absorbans, alla nukleiotider absorberar uv ljus starkt vid 260 nm ev. föroreningar av kromosomalt DNA och RNA

För ett rent DNA ska kvoten ligga mellan 1,8- 2,0

Om det finns föroreningar, absorbansen vid 280 nm blir högre och kvoten blir <1,8

frågor på resultatet:

1. Vilka föroreningar har du förhoppningsvis tagit bort?

Förhoppningsviss att vi tagits bort alla kromosomala DNA, RNA, alla proteiner och cellrester (cell debris).

2.  Vad vet du om resultatet? Fick du ren plasmid

enligt kvoten 2,02 visar att resultatet är bra men det är inte 100% säkert att vi har fått helt rent plasmid, det kan finnas andra proteiner eller andra nukleinsyror som har absorberats vid samma våglängd.

 Enligt tabellen nedan som visar alla värden från andra grupper att vår värde är hamnar inom intervallet och alla värden i tabellen skiljer inte så mycket.

 

3.  Är det något du funderar på som du vill att vi t upp vid genomgång nästa labdag el. vid labuppföljningen? jag vet ej.

För att säkerställa vår renat rekombinantplasmid med LL37 sekvens utförs nästa kontroll steg som är gelelektrofores som genom detta metod kan identifieras LL37 sekvens som utförs under nästa laborationsdag.

 

 

 

 

test